mMESSAGE mMACHINE? 試劑盒設(shè)計(jì)用于體外合成大量的加帽 RNA。加帽 RNA 能模擬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)真核 mRNA，因?yàn)槠湓?5' 端有一個(gè) 7-甲基鳥(niǎo)苷帽結(jié)構(gòu)。mMESSAGE mMACHINE? 試劑盒反應(yīng)包括超高得率轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的帽類似物 [m7G(5')ppp(5')G]。帽類似物僅作為轉(zhuǎn)錄本的第一個(gè)或 5' 終端 G 摻入，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)使得無(wú)法在 RNA 分子中的其他位置將其摻入。

mMESSAGE mMACHINE? 試劑盒如何工作
mMESSAGE mMACHINE? 試劑盒有簡(jiǎn)化的反應(yīng)形式，其中所有 4 個(gè)核糖核苷酸和帽類似物混合于單一溶液中。該溶液的帽類似物:GTP 比值為 4:1，這是盡可能提高 RNA 得率和加帽轉(zhuǎn)錄本比例的理想選擇。mMESSAGE mMACHINE? 試劑盒是對(duì)加帽 RNA 進(jìn)行卵母細(xì)胞顯微注射、體外翻譯、轉(zhuǎn)染和其他應(yīng)用的常規(guī)合成的理想選擇。在存在高核苷酸濃度的情況下，通過(guò)優(yōu)化 RNA 合成的反應(yīng)條件來(lái)實(shí)現(xiàn)高得率。此外，合成的 RNA 不會(huì)被任何可能含有 RNase 抑制劑—（酶混合物的組分）的污染核糖核酸酶降解。

使用 mMESSAGE mMACHINE? 試劑盒
在 2 小時(shí)孵育期間的 20 μL 反應(yīng)中，mMESSAGE mMACHINE? 高得率加帽 RNA 轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生大量的加帽 RNA。該方法獲得的得率為使用常規(guī)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的 10–50 倍。帽類似物與 GTP 的比值已經(jīng)過(guò)優(yōu)化，能夠在得率 (15–35 μg) 和加帽轉(zhuǎn)錄本的比例 (80%) 之間實(shí)現(xiàn)良好折衷。mMESSAGE mMACHINE? 試劑盒還包含一個(gè) LiCl 沉淀溶液，該溶液可有效分離來(lái)自加帽 RNA 的蛋白質(zhì)和未摻入的核苷酸（包括自由帽類似物），提高翻譯效率。mMESSAGE mMACHINE? 試劑盒僅針對(duì)與試劑盒中包含的聚合酶配合使用進(jìn)行了優(yōu)化。使用不同的聚合酶可能會(huì)導(dǎo)致得率低。mMESSAGE mMACHINE? 試劑盒包含 25 次轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的所有緩沖液和試劑。使用試劑盒提供的對(duì)照模板（非洲蟾蜍延伸因子 1α，pTRI Xef），每次 mMESSAGE mMACHINE? 反應(yīng)將使用 T3 或 T7 RNA 聚合酶產(chǎn)生約 20–30 μg 的 RNA，或使用 SP6 RNA 聚合酶產(chǎn)生約 15–25 μg RNA。